Беременная женщина с ребенком
Данное исследование показало, что анализ cfDNA в крови матери с использованием
таргетного секвенирования SNPs на хромосомах 13, 18, 21, X, и Y
и использование алгоритма NATUS является перспективным в качестве точного метода
для обнаружения аутосомных анеуплоидий, анеуплоидий половых
хромосом и триплоидии у плода в первом триместре беременности.

Использование таргетного секвенирования однонуклеотидных полиморфизмов для неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий 13, 18, 21, Х и Y хромосом

K. H. Nicolaides1,2*, A. Syngelaki, M. Gil1*, V. Atanasova1* and D. Markova1*

1 Harris Birthright Research Centre for Fetal Medicine, King’s College Hospital, London, UK
2 Department of Fetal Medicine, University College London Hospital, London, UK
*Correspondence to: Kypros H. Nicolaides. E-mail: kypros@fetalmedicine.com

 

ВВЕДЕНИЕ

Пренатальная ДНК диагностика анеуплоидий у женщин, имеющих высокий риск по результатам пренатального скрининга, требует проведения инвазивной диагностики (биопсии ворсин хориона или амниоцентеза). Однако, инвазивная пренатальная диагностика в 1% случаев является причиной потери беременности. В последние 40 лет пренатальный скрининг был сфокусирован на трисомии 21 хромосомы; полезным следствием такого скрининга стало обнаружение многих клинически значимых анеуплоидий в группе с положительными результатами, подвергшейся инвазивной диагностике и кариотипированию. Наиболее эффективным методом скрининга трисомии 21 хромосомы является оценка сочетания возраста матери, толщины воротникового пространства (измеренного при УЗИ) и биохимического исследования крови матери на свободный β-хорионический гонадотропин чедовека (β-ХГЧ) и PAPP-A в срок 11-13 недель беременности, с частотой выявления до 90% и уровнем ложноположительных результатов до 5% [1]. Использование дополнительных биохимических и ультразвуковых маркеров, включая определение фактора роста плаценты в сыворотке, оценку носовых костей и кровоток через трехстворчатый клапан и венозный проток, могут повысить частоту выявления до более чем 95% и понизить уровень ложноположительных результатов до менее чем 3% [1].

Несколько недавних исследований показали, что наиболее эффективным методом скрининга трисомии 21 хромосомы, с частотой выявления более чем 99% и уровнем ложноположительных результатов около 0,1%, является исследование внеклеточной  ДНК (cell-free DNA, cfDNA) выделенной из плазмы крови матери [2-11]. Существуют два различных подхода к анализу cfDNA: количественный и основанный на исследовании однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) методы. При первом подходе, cfDNA материнской плазмы секвенируют и идентифицируют принадлежность каждой молекулы к той или иной хромосоме путем сравнения с геномом человека. При наличии трисомии у плода, количество молекул, полученных от трисомной хромосомы по сравнению с предполагаемой дисомной референсной хромосомой, является более высоким, чем при эуплоидных беременностях. В противоположность этому, методы, основанные на исследовании SNP, определяют число копий хромосом путем поиска специфических паттернов в аллельных измерениях. В первых отчетах об успешном выявлении трисомии во время беременности с использованием массивного параллельного shotgun секвенирования (MPSS), были идентифицированы и подсчитаны несколько миллионов фрагментов ДНК от всех хромосом [12, 13]. Впоследствии, был применен цифровой анализ выбранных областей (DANSR), при котором осуществлялось селективное секвенирование локусов исследуемых хромосом, тем самым увеличивая производительность и снижая стоимость [14]. Клинические исследования показали, что и MPSS, и DANSR могут с успехом применяться для высокоэффективного скрининга трисомии 21 и 18 хромосом и, в меньшей степени, трисомии 13 хромосомы, у женщин группы высокого риска [4-11, 15-17]. Также имеется одно сообщение о выявлении анеуплоидии половых хромосом методом MPSS [10]. Альтернативой MPSS и DANSR является метод, основанный на исследовании SNP, включающий в себя таргетную амплификацию и анализ 19488 SNPs на хромосомах 21, 18, 13, X, и Y в одной реакции [18]. Затем применяется статистический метод максимального правдоподобия для определения количества хромосомного материала от пяти хромосом, исследуемых в каждом образце. Поскольку данный метод анализирует аллельное распределение и не требует использования дисомной референсной хромосомы, ожидается, что он однозначно будет способен обнаруживать триплоидии.

Целью данного исследования являлась оценка способности метода, основанного на исследовании SNP в сочетании с алгоритмом, называемым NATUS (Next-generation Aneuploidy Test Using SNPs – тест на анеуплоидии следующего поколения, использующий SNP) для обнаружения трисомии 21, 18, и 13 хромосом, анеуплоидий половых хромосом, и триплоидии в образцах материнской крови.  

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Группа пациентов

Данные для этого исследования были получены при 242 одноплодных беременностях, при которых был исследован кариотип плода после биопсии ворсин хориона в срок 11-13 недель, поскольку комбинированный скрининг показал, что риск трисомии 21, 18 или 13 хромосом был более 1:300 (n=227), или была выявлена анеуплоидия при предыдущей беременности (n=6) и возраст матери старше 35 лет (n=5), или женщины проходили инвазивную диагностику на серповидно-клеточную анемию и также хотели исследовать кариотип плода (n=4). В день биопсии ворсин хориона, гестационный возраст был определен при помощи измерения копчико-теменного размера плода [19], а риск трисомий 21, 13 и 18 хромосомы был рассчитан при измерении толщины воротникового пространства и свободного β-ХГЧ и PAPP-A сыворотки [1, 20, 21].

Образцы материнской венозной крови (20 mL in Streck cell-free DNA BCTTM tubes) были получены до биопсии ворсин хориона при 242 одноплодных беременностях. Пациенты дали письменное информированное согласие предоставить образцы для исследования с целью раннего прогнозирования осложнений беременности.

Лабораторный анализ

Образцы материнской крови были отправлены в лабораторию Натера, в Сан-Карлос, Калифорния. Информация, предоставленная в лабораторию по каждому из образцов была следующей: уникальный код пациента, возраст матери, гестационный возраст, расовая принадлежность и дата забора крови, но не кариотип плода. Натера подтвердила достаточный объем и адекватную маркировку, и никакие образцы не были исключены из анализа.

Подготовка образцов (включая изоляцию cfDNA и материнской геномной ДНК из лейкоцитов) и оценка (включая ПЦР-амплификацию, секвенирование и информационный анализ результатов секвенирования) были выполнены, как описано ранее [18], с двумя изменениями, заключающимися в следующем: во-первых, количество отдельных ПЦР-проб, включенных в одну реакцию увеличилось с примерно 11000 до 19488 проб, а во-вторых, результаты секвенирования были проанализированы с помощью усовершенствованной версии алгоритма с расширенными возможностями для анализа данных от 19488 проб (NATUS). NATUS анализирует ряд показателей контроля качества для выявления ошибок лаборатории или секвенирования, оценки количества общей исходной ДНК, определения фракции фетальной ДНК и рассчитывает степень, в которой данные измерения cfDNA будут соответствовать ожидаемым в каждом конкретном случае распределений. В данном исследовании, определение плоидности не проводилось, если в образце было менее 3,5% фракции фетальной ДНК, если количество вводимой ДНК было ниже 1500 эквивалентов генома, или контаминация была больше, чем 0,2%. Информация о материнском генотипе была включена в анализ, как описано ранее [18].

Результаты были представлены в виде числа копий пяти хромосом, исследованных в каждом образце, вместе с вычисленной погрешностью по каждой хромосоме. Затем определяли корреляцию между результатами анализа и кариотипом плода.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Средний возраст матери в исследуемой группе составил 35,7 (диапазон 18,5–46,5) лет, а средний гестацонный возраст на момент отбора проб составил 13,1 (диапазон: 11.3-13.9) недель. Средний предполагаемый риск трисомии 21, 18 или 13 хромосом при комбинированном тесте был 1:75 (диапазон 1:2 - 1:12433).

Результаты анализа cfDNA в крови матери были представлены для 229 (94.6%) из 242 случаев. В 13 случаях (5,4%), в том числе в двух случаях трисомии 21 и 11 хромосомы у эуплоидных плодов, результат не был получен, поскольку образцы не прошли внутренний контроль качества по одной или более из следующих причин: недостаточное количество общей ДНК после пробоподготовки (менее 1500 единиц геномной ДНК), недостаточная фракция фетальной ДНК (менее 3,5%) или высокий уровень шума, который может включать высокий уровень контаминации или низкий параметр пригодности модели из-за, например, узких мест (к узким местам относят избыточную дискретизацию слишком малого количества оригинальных фрагментов ДНК). Самая низкая фракция фетальной ДНК, при которой был получен результат составляла 3,95%. В группе с отсутствием результата, по сравнению с группой где результат был получен, средний уровень РАРР-А был значительно ниже (0,520 против 0,892 МоМ, Mann–Whitney U-test p = 0.016), а средний вес матери достоверно не различался (77,2 против 68,5 кг, p = 0.141).

Кариотипы плода, полученные при исследовании ворсин хориона в 229 случаях и предсказанное число копий хромосом X, Y, 21, 18 и 13 приведены в таблице 1. При исследовании cfDNA с использованием SNPs были правильно идентифицированы все случаи аутосомных трисомий и синдрома Тернера, с отсутствием ложноположительных результатов, и правильно определен пол плода во всех случаях. В одном случае триплоидии, при исследовании cfDNA было обнаружено множество материнских гаплотипов, что указывает или на многоплодную беременность, или на триплоидию; поскольку УЗИ подтвердило одноплодную беременность, образец был идентифицирован как триплоидный (69,XXX). Сравнение расчетного риска анеуплоидий при комбинированном тесте с результатами исследования cfDNA приведено на рисунке 1. Во всех случаях трисомии 21 хромосомы, число ее копий было равно трем, с достоверностью 99,9% (чувствительность: 100%; CI: 86.3–100%; специфичность: 100%; CI: 98.2–100%). Во всех случаях трисомии 18 хромосомы, число ее копий было равно трем, с достоверностью 99,9%, в случае трисомии 13 хромосомы, число ее копий было равно трем, с достоверностью 99,9%; в случае синдрома Тернера, число копий Х хромосомы было равно одному, а число копий Y хромосомы – нулю с достоверностью 99,9%. В случае триплоидии, число копий хромосом 13, 18, 21, и X было равно трем, а число копий хромосомы Y – нулю. Из-за небольшого количества образцов с трисомиями 13, 18, моносомией X хромосомы и триплоидиями, чувствительность и специфичность не сообщаются. У 116 плодов мужского пола была одна копия Х хромосомы, с точностью 99,9% во всех случаях и одна копия хромосомы Y, с средней достоверностью 99,9% (диапазон: 96,0–99,9%). У 109 плодов женского пола, за исключением двух случаев синдрома Тернера и одного случая триплоидии, число копий хромосомы Х было равно двум, а хромосомы Y – нулю, с средней достоверностью 99,9% (диапазон: 96,0-100%).

Кариотипы плода. Результаты.

 Таблица 1. Кариотипы плода, полученные при биопсии ворсин хориона в 229 случаях, с результатами исследования cfDNA и предсказанное число копий хромосом X, Y, 21, 18 и 13

Распределение риска

Рисунок 1. Распределение риска анеуплоидий при комбинированном тесте (слева) и анализе cfDNA (справа) при эуплоидных (черные точки) и анеуплоидных (красные точки) беременностях, нанесенных на график в соответствии с копчико-теменным размером плода.

ОБСУЖДЕНИЕ

Основные результаты этого исследования

Данное исследование показало, что основанный на SNP анализ cfDNA в крови матери, полученной на сроке от 11 до 13 недель одноплодной беременности, протекающей с высоким риском хромосомной патологии плода, правильно определил все случаи трисомий 21, 18 и 13 хромосом, синдрома Тернера и триплоидию с отсутствием ложных срабатываний и правильно определил пол плода во всех случаях. Тест не дал результатов в 5,4% случаев, для которых будет рекомендовано проведение повторного анализа.

Беременности, отнесенные к группе высокого риска трисомий 21, 18 и 13 хромосом на основании возраста матери, данных ультразвукового исследования и биохимического исследования сыворотки крови матери, являются причиной, по которой родители принимают решение о биопсии ворсин хориона и кариотипировании плода. В связи с этим, исследование населения отражает современную клиническую практику в Великобритании и многих других странах, где скрининг и диагностика анеуплоидий основаны на комбинированном тесте в первом триместре и биопсии хориона, соответственно.

Сравнение результатов и метода анализа cfDNA с предыдущими исследованиями

Существует множество доказательств из результатов предыдущих исследований, в общей сложности 594 случаев трисомии 21 хромосомы, 193 случаев трисомии 18 хромосомы и 38 случаев трисомии 13 хромосомы, что тестирование cfDNA в крови матери может определить более 99%, 97 %, и 79% случаев соответственно, с соответствующими ложноположительными результатами 0,1%, 0,1% и 0,4% на каждую анеуплоидию. [4-11, 13, 14, 16, 17]. В нашем исследовании были правильно определены все три вида трисомий без ложных срабатываний, но с признанием того факта, что число случаев трисомии 18 и 13 хромосомы было слишком мало, для надежной оценки теста.

Предыдущие исследования использовали MPSS или DANSR для анализа cfDNA в крови матери. Оба метода определяют плоидность плода путем измерения отношения между количеством прочтений соответствующих интересующей хромосоме и таких же, соответствующих референсной диплоидной хромосоме. Поскольку MPSS не является избирательным в отношении хромосомного происхождения секвенируемых фрагментов ДНК, а хромосома 21 составляет лишь около 1,5% генома человека, необходимо секвенировать много миллионов фрагментов для обеспечения достаточного числа 21 хромосом, чтобы получить более достоверный результат. Хотя данный метод и показал возможность выявлять структурные перестройки, для достижения этого необходимо получить очень большое число прочтений [22]. При DANSR подходе, проводят селективное секвенирование локусов только 21, 18, и 13 хромосом с последующим десятикратным уменьшением в требуемой последовательности ДНК по сравнению с MPSS подходом, что ведет к повышению эффективности.

Подход в данном исследовании: селективная амплификация и секвенирование полиморфных локусов, таргетное исследование 19488 SNPs, покрывающих 21, 18, 13, X и Y хромосомы, и определение числа копий с помощью анализа NATUS результатов секвенирования. Этот метод отличается от предыдущих тем, что он использует информацию о материнском генотипе и частоты рекомбинации для построения in silico миллиардов возможных генотипов плода. Затем он сравнивает каждую гипотезу с фактическими измерениями плазмы и вычисляет относительную вероятность для каждой гипотезы. Метод рассматривает только возможные генотипы плодов и не требует использования дисомных референсных хромосом. Во-первых, это единственный доступный в настоящее время метод, позволяющий выявлять триплоидии. Во-вторых, он позволяет избежать низких частот выявления хромосом, которые склонны к высокому уровню вариаций амплификации, такие как хромосомы 13 и Х. Как показано в этом исследовании, было возможно правильно определить случай триплоидии, но было необходимо подтвердить данное изменение, изучив значительно большее число подобных беременностей. Тест правильно определил пол плода во всех случаях и обнаружил два случая синдрома Тернера в обследованной группе. Точность выполнения теста при выявлении трисомии 13 хромосомы, трисомии 18 хромосоы и анеуплоидий половых хромосом требует дальнейшего изучения.

Ограничения исследования

Тест не дал результат в 5 % случаев, и одной из причин этого была низкая фракция фетальной ДНК. В группе с отсутствием результата, по сравнению с группой, в которой он был получен, средний уровень сывороточного PAPP-A был значительно ниже, а материнский вес был больше, но разница не была значительной. Это согласуется с предыдущим отчетом об увеличении фетальной фракции ДНК с увеличением PAPP-A в сыворотке крови и уменьшении ее с увеличением веса матери, что может быть следствием эффекта дилюции [23].

Хотя в Великобритании и большинстве других стран скрининг анеуплоидий, по существу, фокусируется на скрининге трисомии 21 хромосомы, инвазивная диагностика в группе с положительными результатами скрининга приводит к обнаружению множества дополнительных клинически значимых анеуплоидий.  В данном исследовании было выявлено по одному случаю трисомии 22 хромосомы, делеции 2 хромосомы и делеции 15 хромосомы. Следовательно, потенциальная критика замены традиционных методов скрининга трисомии 21 хромосомы исследованием материнской cfDNA может состоять в том, что многие клинически значимые цитогенетические аномалии, выявляемые в настоящее время, не будут найдены. Однако, профиль биомаркеров для многих редких анеуплоидий четко не определен, и неясно, является ли их частота в группе положительного скрининга на трисомию 21 хромосомы выше, чем в группе отрицательного скрининга. Ожидается, что методы, основанные на исследовании SNP смогут выявлять такие клинически значимые анеуплоидии, в том числе микроделеции и микродупликации, но это потребует выбора специфических локусов для таргетного исследования.

Практическое значение

Результаты этого исследования являются еще одним доказательством, что производительность неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий, основанной на анализе cfDNA и обнаружении трисомий 21, 18 и 13 хромосом значительно превосходит все современные методы, которые зависят от возраста матери, УЗИ плода, а также биохимии материнской сыворотки. Это хорошо видно на рисунке 1, где сравнивается риск анеуплоидий, рассчитанный при комбинированном тесте с данными исследования cfDNA. Эти данные также демонстрируют потенциал расширения границ скрининга, включением в исследование анеуплоидий половых хромосом и триплоидии.

В это исследование, как и в большинство предыдущих, были включены беременности высокого риска. Тем не менее, способность выявлять анеуплоидии с помощью cfDNA зависит от точности анализа и процента фетальной ДНК в образце, а не распространенности заболевания в исследуемой популяции, и ранее было показано, что скрининговое исследование cfDNA в общей популяции является столь же эффективным, как и в группах высокого риска [11]. Следовательно, от того, станет ли доступ к данному исследованию сравнимым с существующими методами УЗИ и биохимического скрининга будет зависеть, в какой мере исследование cfDNA может применяться в качестве универсального инструмента скрининга анеуплоидий у всех беременных женщин. В то же время, анализ cfDNA может быть полезным в качестве теста второй линии по результатам более широко применяемых основных методов скрининга.

Как показано в данном исследовании, большинство беременностей, при которых комбинированный тест выявил высокий риск трисомий 21, 18 или 13 хромосомы, являются эуплоидными, и в таких случаях, использование анализа cfDNA могло бы значительно снизить количество ненужных инвазивных тестов и устранить связанный с ними риск потери беременности. К другой группе беременных, которые могут извлечь пользу из скрининга по cfDNA, относят имеющих промежуточный риск аутосомных трисомий по результатам комбинированного теста. По результатам исследования cfDNA, риск будет пересмотрен либо как очень высокий, либо, как очень низкий, тем самым облегчая принятие решения за или против инвазивной диагностики [24, 25]. 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данное исследование показало, что анализ cfDNA в крови матери с использованием таргетного секвенирования SNPs на хромосомах 13, 18, 21, X, и Y и использование алгоритма NATUS является перспективным в качестве точного метода для обнаружения аутосомных анеуплоидий, анеуплоидий половых хромосом и триплоидии у плода в первом триместре беременности.

ЛИТЕРАТУРА

1. Nicolaides KH. Screening for fetal aneuploidies at 11 to 13 weeks. Prenat Diagn 2011;31:7–15.

2. Lo YM, Corbetta N, Chamberlain PF, et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet 1997;350:485–7.

3. Chiu RW, Akolekar R, Zheng YWL, et al. Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing: large scale validity study. BMJ 2011;342:c7401.

4. Ehrich M, Deciu C, Zwiefelhofer T, et al. Noninvasive detection of fetal trisomy 21 by sequencing of DNA in maternal blood: a study in a clinical setting. Am J Obstet Gynecol 2011;204:205 e1–11.

5. Palomaki GE, Kloza EM, Lambert-Messerlian GM, et al. DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: an international clinical validation study. Genet Med 2011;13:913–20.

6. Sehnert AJ, Rhees B, Comstock D, et al. Optimal detection of fetal chromosomal abnormalities by massively parallel DNA sequencing of cell-free fetal DNA from maternal blood. Clin Chem 2011;57:1042–9.

7. Sparks AB, Struble CA, Wang ET, et al. Non-invasive prenatal detection and selective analysis of cell-free DNA obtained from maternal blood: evaluation for trisomy 21 and trisomy 18. Am J Obstet Gynecol 2012;206:319.e1–9.

8. Ashoor G, Syngelaki A, Wagner M, et al. Chromosome-selective sequencing of maternal plasma cell-free DNA for first-trimester detection of trisomy 21 and trisomy 18. Am J Obstet Gynecol 2012;206:322.e1–5.

9. Norton ME, Brar H, Weiss J, et al. Non-Invasive Chromosomal Evaluation (NICE) Study: results of a multicenter prospective cohort study for detection of fetal trisomy 21 and trisomy 18. Am J Obstet Gynecol 2012;207:137.e1–8.

10. Bianchi DW, Platt LD, Goldberg JD. Genome-wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing. Obstet Gynecol 2012;119:890–901.

11. Nicolaides KH, Syngelaki A, Ashoor G, et al. Noninvasive prenatal testing for fetal trisomies in a routinely screened first-trimester population. Am J Obstet Gynecol 2012;207:374.e1–6.

12. Fan HC, Blumenfeld YJ, Chitkara U, et al. Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2008;105:266–71.

13. Chiu RW, Chan KC, Gao Y, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci USA 2008;105:20458–63.

14. Sparks AB, Wang ET, Struble CA et al. Selective analysis of cell-free DNA in maternal blood for evaluation of fetal trisomy. Prenat Diagn 2012;32:1–7.

15. Chen EZ, Chiu RW, Sun H, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal trisomy 18 and trisomy 13 by maternal plasma DNA sequencing. PLoS One 2011;6:e21791.

16. Palomaki GE, Deciu C, Kloza EM, et al. DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18 and trisomy 13 as well as Down syndrome: an international collaborative study. Genet Med 2012;14:296–305.

17. Ashoor G, Syngelaki A, Wang E, et al. Trisomy 13 detection in the first trimester of pregnancy using a chromosome-selective cell-free DNA analysis. Ultrasound Obstet Gynecol 2013;41:21–5.

18. Zimmermann B, Hill M, Gemelos G, et al. Noninvasive prenatal aneuploidy testing of chromosomes 13, 18, 21, X, and Y using targeted sequencing of polymorphic loci. Prenat Diag 2012;32:1233–41.

19. Robinson HP, Fleming JE. A critical evaluation of sonar crown rump length measurements. Br J Obstet Gynaecol 1975;182:702–10.

20. Wright D, Kagan KO, Molina FS, et al. A mixture model of nuchal translucency thickness in screening for chromosomal defects. Ultrasound Obstet Gynecol 2008;31:376–83.

21. Kagan KO, Wright D, Spencer K, et al. First-trimester screening for trisomy 21 by free beta-human chorionic gonadotropin and pregnancy-associated plasma protein-A: impact of maternal and pregnancy characteristics. Ultrasound Obstet Gynecol 2008;31:493–502.

22. Srinivasan A, Bianchi DW, Huang H, et al. Noninvasive detection of fetal subchromosome abnormalities via deep sequencing of maternal plasma. Am J Human Genet 2013;92:1–10.

23. Ashoor G, Poon L, Syngelaki A, et al. Fetal fraction in maternal plasma cell-free DNA at 11–13 weeks’ gestation: effect of maternal and fetal factors. Fetal Diagn Ther 2012;31:237–43.

24. Nicolaides KH, Spencer K, Avgidou K, et al. Multicenter study of first-trimester screening for trisomy 21 in 75 821 pregnancies: results and estimation of the potential impact of individual risk-orientated two-stage first-trimester screening. Ultrasound Obstet Gynecol 2005;25:221–6.

25. Nicolaides KH, Chervenak FA, McCullough LB, et al. Evidence-based obstetric ethics and informed decision-making by pregnant women about invasive diagnosis after first-trimester assessment of risk for

trisomy 21. Am J Obstet Gynecol 2005;193:322–6. Validation study of cfDNA testing using SNPs 579 Prenatal Diagnosis 2013, 33, 575–579 © 2013 John Wiley & S